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💊 GPCR 藥物研發工具新品發佈 GTP Gi Binding Assay • β-Arrestin Assay Kits
G 蛋白偶聯受體 (G protein-coupled receptors, GPCRs) 是人體中最大的蛋白質家族，有 826 個成員 [1, 3]。人體內多達三分之二的荷爾蒙 (hormones) 與神經傳導物質 (neurotransmitters) 是經由與 GPCRs 結合發揮調節作用 [2]，因此 GPCRs 對各種生理功能皆具有舉足輕重的影響力，是極佳的藥物作用標靶。截至 2020 年 6 月共有 527 種靶向 GPCRs 的藥物獲得美國食品藥物管理局 (FDA) 批准 [1]，佔所有 FDA 批准藥物的三分之一以上，應用範圍幾乎涵蓋所有人類主要疾病，包含癌症、糖尿病、阿茲海默症 (Alzheimer's disease)、帕金森氏症 (Parkinson's disease)、缺血性中風 (ischemic stroke)、失眠、偏頭痛、肥胖...... [1, 3, 4]，顯示 GPCRs 在醫療領域的重要性與強大發展潛力！
由伯森所代理的 Revvity 公司具有超過 80 年的研發和製造歷史，深入了解藥物開發領域的研究需求，所提供的 GPCR 藥物研發實驗解決方案包含：GPCR 表現細胞株／細胞膜 (GPCR cell lines & membranes)、放射性配體 (radioligands)、生物分子檢測平台、微量多孔盤與多功能盤式分析儀等一系列研究試劑與工具，從受體-配體結合試驗 (receptor-ligand binding assay) 到區別 G protein 或 β-Arrestin 傳導路徑、乃至 cAMP、鈣離子與磷酸化蛋白質檢測等，完整涵蓋了 GPCR 訊息傳導路徑的上下游分析需求。您可以在《GPCR 藥物開發產品目錄》中找尋到相關產品介紹，或歡迎您直接洽詢伯森業務專員。以下我們將為您介紹 Revvity 旗下 Cisbio 研發團隊最新推出的 GTP Gi binding 與 β-Arrestin 檢測試劑。
檢測原理 在 GPCRs 經典訊息傳導路徑中，配體與 GPCRs 結合後會促使原本結合在 G 蛋白 α 次單元的 GDP 被置換為 GTP，使 G 蛋白轉變為活化態。活化後的 G 蛋白，其 α 次單元會與 β/γ 次單元分離，各自執行其下游訊息傳導功能。GTP Gi binding assay kit 檢測原理是基於 HTRF 技術，利用標定有供體螢光 Eu cryptate 的非水解型 GTP 類似物和標定有受體螢光 d2 的 Gαi 專一性抗體進行偵測。當 Gαi 活化與 GTP 结合時，供體螢光與受體螢光間的距離即會被拉近並產生 HTRF 訊號，訊號強度將與 Gi 蛋白的活化程度成正比。
實驗流程 在 96-well 或 384-well 微量多孔盤孔洞中依序加入待測藥物、配體、預混合好的偵測試劑 “Eu cryptate GTP 與 d2 Gαi Ab” 以及 GPCR 表現細胞膜，於室溫下靜置 3 小時（或 1 晚）即可進行訊號偵測。
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檢測原理 目前已知 β-Arrestin 與 GPCRs 的去敏感化 (desensitization) 和內化作用 (internalization) 相關，具有調節 GPCRs 訊息傳導路徑的功能。Beta-Arrestin recruitment kit 即是用來篩選具有調控 β-Arrestin 2 與磷酸化 GPCRs 結合能力的藥物，其檢測原理同樣是基於 HTRF 技術，利用標定有供體螢光 Eu cryptate 的 β-Arrestin 2 專一性抗體和標定有受體螢光 d2 的 AP2* 專一性抗體進行偵測（*β-Arrestin 與磷酸化 GPCRs 結合後，隨即會招募 AP2 與其結合）。若待測藥物能夠促使細胞內的 β-Arrestin 2 與磷酸化 GPCRs 結合，供體螢光與受體螢光間的距離即會被拉近並產生 HTRF 訊號，訊號強度將與藥物的促進能力成正比。
實驗流程 在 96-well 細胞培養盤 (CulturPlate-96) 中，將細胞與待測藥物混合進行培養，接著加入穩定液反應後進行沖洗，最終加入偵測試劑 “Eu cryptate β-Arrestin 2 Ab 與 d2 AP2 Ab”，於室溫下靜置 1 晚即可進行訊號偵測。
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檢測原理 Total β-Arrestin 1 cellular kit, Total β-Arrestin 2 cellular kit 和 Total AP2 cellular kit 這三款產品可分別用來檢測細胞內 β-Arrestin 1、β-Arrestin 2 和 AP2 蛋白質的表現量。檢測原理同樣是基於 HTRF 技術，利用兩支分別標定有供體螢光 Eu cryptate 和受體螢光 d2 的 β-Arrestin（或 AP2）專一性抗體進行偵測。隨著抗體與目標蛋白質的專一性結合，供體螢光與受體螢光間的距離將會被拉近並產生 HTRF 訊號，訊號強度將與目標蛋白質的表現量成正比。
實驗流程 首先以套組提供的 Lysis buffer 裂解細胞，取得細胞溶解物。接著將兩支抗體與樣本（標準品或細胞溶解物）混合，於室溫下靜置 3 小時即可進行訊號偵測。
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