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Multicolor flow cytometry
在開始設計多色流式細胞分析實驗前，必須預先確定實驗室流式細胞儀所搭載的：(1) 雷射光源類型與數量、(2) 螢光濾片種類、(3) 偵測器數量。根據以上資訊，才能知道有哪些螢光染劑可以作為設計實驗時的選項。簡單來說，雷射光源決定哪些激發波長 (Excitation wavelength) 的螢光染劑可以適用，螢光濾片與偵測器則決定哪些發射波長 (Emission wavelength) 的螢光染劑訊號可以通過並被檢測得到。
某些細胞本身就極為罕見數量稀少，某些待測抗原則可能因為細胞活化狀態或細胞功能的不同而表現量較低。針對這些情況，一般會選用最亮的螢光染劑進行偵測，例如：PE 染劑通常會用在罕見細胞族群以及抗原表現量較低（或表達情況不明）的樣本偵測。而當待測抗原是高表現量時，則建議使用較暗的螢光染劑進行偵測，例如 PerCP。要特別提醒的是，還有諸多因素會影響到螢光染劑的亮度，例如使用的實驗緩衝液以及流式細胞儀機型等。您可以透過【Fluorochrome Chart】快速查詢到各種常用螢光染劑的相對亮度、適用雷射光源等資訊。
若是僅以螢光亮度作為選擇螢光染劑的基準（例如僅選用強亮度染劑），很容易會遇到螢光染劑間發射光譜重疊的情形，造成實驗結果判讀不易、解析度下降。因此在設計多色流式細胞分析實驗時，寧可適當犧牲亮度選用較暗的染劑，以避免彼此間發射光譜重疊，並减少所需的螢光補償 (Fluorescence compensation)。
在進行複雜的多色流式細胞分析實驗時，設立完整的對照組可幫助科研人員準確判讀實驗結果及排除可能的訊號干擾因素。應包含的實驗對照組有：未染色的細胞樣本（以了解樣本自體螢光 (Autofluorescence) 情形，並界定出陰性族群）、細胞存活染色（以區別死細胞產生的偽陽性螢光訊號）、用來建立螢光補償的單螢光染色樣本以及用來準確圈選出特定染色細胞族群的螢光減一 (Fluorescence minus one, FMO) 多染色樣本。除此之外，尚有作為陰性對照組的基因剔除 (Gene knockout) 細胞樣本以及用來排除抗體非專一性結合偽陽性訊號的同型對照抗體 (Istotype control antibodies) 染色樣本。更多對照組詳細說明，可參見【Recommended controls for flow cytometry】。
抗體濃度：不適當的抗體濃度，有可能會造成非專一性結合反應增加或是降低偵測靈敏度。因此所有使用的抗體均需滴定量測出最佳染色濃度，以確保實驗結果具有良好的訊噪比 (Signal to noise ratio)。 Fc 阻斷 (Blocking)：吞噬細胞 (Phagocytes)（例如單核球 (Monocytes)）這類細胞表面均表現有 Fc 受體 (Fc receptors, FcR)，該受體會與螢光染色抗體的 Fc 區域形成非專一性結合，造成偽陽性結果。可以透過使用 FcR 阻斷劑──例如 Anti-CD16+CD32 antibody (ab25235)（適用於小鼠樣本）、或是 Human IgG（適用於人類樣本）來改善此問題。組織樣本（可能含有巨噬細胞 (Macrophages)）的均質化步驟、或是 Daudi 和 THP-1 等細胞株染色前，均建議添加使用 FcR 阻斷劑。 透過實施以上 5 個要點，您將可以更加完善順暢地設計與運行複雜的多色流式細胞分析實驗，同時避免許多常見錯誤。更多 Flow cytometry 研究產品資訊與最新活動訊息，歡迎洽詢 Abcam 台灣代理 — 伯森生技 (線上留言諮詢 • 伯森業務專員聯絡資訊)。您可透過下方連結瀏覽更多相關資訊： |
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流式細胞技術 (