Western Blot ( WB ) 是生科領域研究人員最常進行的分析實驗，但這樣一個普遍、簡易的研究方法，卻常會出現各種稀奇古怪的問題。

當我們進行 WB 分析目標蛋白時……

Band 的位置與預期不同？ 請先檢查這 5 點！

面對這種實驗結果，該如何判定問題出在哪裡？ Abcam 提供您以下五條分析準則：

(1) 內源性蛋白 or 重組蛋白
追本溯源，先檢查樣本是內源性蛋白還是重組蛋白？若是重組蛋白，就要看它是否為全長序列 ( full-length )。若非全長，則 band size 自然會與目標蛋白的預測位置不同。

(2) 是否有其他 Isoform
若樣本為內源性蛋白，那研究者們務必去看它有沒有其他 Isoform？可以透過 Abcam 產品網頁 Datasheet 分頁裡的 "Target" 標籤，快速找尋到 Database links 資訊，裡面有該蛋白的 SwissProt 網頁連結，可直接點擊前往查詢。

(3) 是否有剪切活化
若在 SwissProt 資料庫或是文獻中提到蛋白需要剪切活化，則結果自然會與目標蛋白的預測位置不同。

(4) 是否為 Dimer 或 Polymer
如果 WB 的結果與目標蛋白的預測大小有倍數關係，則有可能這個蛋白是 Dimer 或 Polymer 。

(5) 蛋白是否有修飾
除上述 4 種原因，預測值與實驗結果不同，也很可能是蛋白有受到轉譯後修飾，例如常見的：Phosphorylation, Acetylation, N-linked glycosylation, Amidation, Hydroxylation, Methylation, O-linked glycosylation, Ubiquitylation, Sulfation 等。
不同狀態下的蛋白質會有不同的修飾，加入官能基後，蛋白的分子量一定會比預測值大。Glycosylation 是較為常見的修飾，它會使蛋白質的分子量上升。

我們可以將以上敘述，簡化為下方圖表。下次再遇到 WB band 與目標蛋白的預測位置不同時，您就可以參照圖表迅速想起這五個提示：

• 確認樣本是內源性蛋白或重組蛋白；若是重組蛋白，確認是否為全長序列。
• 善用 SwissProt 資料庫，看目標蛋白是否有其他 Isoform 。
• 確認 SwissProt 資料庫與文獻是否有提及剪切活化，造成分子量變小。
• 確認樣本蛋白是否為 Dimer 或 Polymer 。
• 使用 SwissProt 或其他資料庫（如 NCBI）查詢蛋白是否有轉譯後修飾，造成分子量上升。

以上就是 Abcam 提供的五條分析準則，若是仍沒找到問題，就要回頭檢視是否為實驗流程出錯了。