核酸引子合成 (Custom oligonucleotide synthesis)
1. Synthesis scale和Guaranteed
amount(保證量)的區別為何？
目前Oligo (Primer)的產量計算方式有兩種：
A. Synthesis scale─通常以umole或nmole為單位，這是指上機前的起始物。
B. Guaranteed amount(保證量) ─ 通常以OD為單位，這是指完成所有合成步驟：如synthesis、cleavage、
deprotection、purification之後再經過嚴格的品質管制及定量，每一條引
子皆為您所指定的2O.D.、5O.D.或其它數量。
2. Oligo(Primer)純化方式的區別及原理？
本公司提供三種純化方式：
A. Desalt (脫鹽) ─ 將cleavage完成後的粗產物以G-25的分子篩管柱去除合成過程中的小分子不純物。
如此可提高PCR成功率。
B. OPC─是利用疏水性(hydrophobicity)不同的原理，來分離全長(full
length)及合成不完全的核酸引子，
以提高產品中，完整全長的 Oligo 純度。
在合成的最後一個步驟，執行 DMT-ON mode，只有全長的核酸引子會保留 5'- 端最後一個
DMT保護基；因此其疏水性會大於沒有在 5'- 端保留 DMT 的合成不完全的核酸引子來的高，
在通過特殊的 OPC column 後，可以使兩者分離出來。依此方法生產的 Oligo 純度可比
desalted Oligo 提高至少 10%。
C. HPLC ─ 詳細分析原理如下述。
本公司的 HPLC 系統為 IP-RP HPLC (ion-pairing reversed-phase HPLC)，管柱藉由吸附在表
面上帶正電的 ion-pairing reagent 與 oligo 上帶負電的磷酸二酯鍵結合而使 oligo 滯留在管
柱上，隨後再以疏水性漸增的溶液將 oligo 沖提出來。由於 oligo 與管柱的結合力與 oligo
骨架上的磷酸二酯鍵數目成正比，oligo 的長度愈大，滯留時間愈長，因此而得以分離不
同大小的 oligo。流洗液經紫外光偵測器測定在260nm波長的吸光值，經由層析圖分析主
要吸收波佔總吸光值比例得到的數值，就是我們用以量化oligo 純度的依據。
下圖為我們的系統對於 oligo 的分析結果。樣品中含有兩個長度只差一個 mer 的oligo，
大小分別是 20 mer 與 21 mer，由層析圖顯示，這套系統可以有效分離這兩條 oligo。藉著
這套系統，我們亦可純化特定長度的Oligos。
3. 為何強烈建議大於50mers的Oligo(Primer)要進一步純化？
由於合成儀的效率無法達到 100%，合成產物在未經純化前的純度 (全長的比例) 會因為每一次的合
成效率 (coupling efficiency) 而有不同。舉例來說，合成效率在 98.5% 時，20 mer 的核酸引子純度將
達到 (0.985) ，相當於純度為
74%；50 mer 的核酸引子純度將達到 (0.985) ，相當於純度為
47%。
因此為了您的實驗順利，我們建議您訂購進一步純化的核酸引子。
本公司以HPLC抽樣檢驗及積分定量，要求每一批出產的 desalted oligo 皆達到合成效率
98.5%，下表
列出幾個不同長度的oligo出貨的品管標準。
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長度
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純度
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Note:
Purity is defined as the percent full length product,
assuming the coupling efficiency of 98.5%. |
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20 mers
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74%
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30 mers
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64%
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40 mers
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55%
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50 mers
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47%
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4. 應該如何保存Oligo(Primer)及其保存期限？
基本上，當您拿到本公司製造的核酸引子粉末可保存數年。一旦回溶後，oligos易被核酸水解酵素
(nuclease) 所分解；即便如此，假使操作正確而不被污染（nuclease free），水溶液中的 oligos 置於
-20℃ 仍可保存數年。
一般而言，DNA oligos 要避免放在 pH<3 環境下 ( 易造成 depurination/cleavage)；而
RNA oligos 要避
免高 pH 值 (因 alkaline hydrolysis)；因此建議將 dried oligos 溶於無菌去離子水或 TE
buffer (10 mM
Tris pH 8.0, 1 mM EDTA)，並使其體積莫爾濃度為 100mM 以便使用；我們建議您將 oligo 分管儲存、
分批使用以避免污染。
＊ 若為螢光標訂的 oligo，則請避光置於-20℃儲存。
5. 最終產物的Oligo(Primer)不含鹽類嗎？
一般合成之核酸引子，製造過程中並不加入無機鹽類如鈉 (sodium)、鎂 (magnesium)；純化核酸引
子所使用desalting 一詞意指去除合成過程以及合成後處理時所產生小分子的不純物。
6. 最終產物的Oligo(Primer)在 3'
或 5' 端是否有 phosphate？
標準的化學合成的oligonucleotide 其 3' 及 5' 端均帶氫氧基（hydroxyl group）。若您的實驗上有需要
在 5' 或 3' 進行磷酸化作用（phosphorlyation）請在您的訂單上註明或與我們聯絡。
7. 為什麼我的Oligo(Primer)在 PAGE 圖上的位置偏低（或偏高）？
根據本公司的標準作業程序，我們可以確保自動化合成時輸入的序列符合您訂單的序列。合成完成
後，並以 PAGE 來檢驗 oligo 的長度。本公司所使用的 PAGE（Polyacrylamide Gel Electrophoresis），
為含有 7M Urea 的 denaturing gel，所以在進行電泳分析時，大部分的 oligo 並不會形成 self-dimer
或
hairpin 等二級結構，理論上，在膠片上的位置與 oligo 的分子量成正比。
一般而言，oligo 與 本公司特製的 size marker 做相對位置比較後，可以約略的比較出其分子量；但
是特殊少數的 oligo sequence，例如（GC）比例太高，或著 oligo 的ΔG 值太高…等因素，而造成 7M
Urea亦無法抑制 oligo 的各種二級結構的形成，因此會影響其在 PAGE 上的位置。如果您仍對拿到的
oligo 序列有疑問，敬請您來電反應，我們將盡力為您排難解疑。
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